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超氧化物歧化酶简称SOD是一种广泛存在于动物、植物、微生物中的金属酶，按金属辅基的不同可分为CUZNSOD，MNSOD，FESOD和NISOD。铜锌超氧化物歧化酶CUZNSOD是一种重要的氧自由基清除剂，在体内自由基的产生与消除的动态平衡中起关键作用，主要催化超氧化物阴离子自由基发生歧化反应，生成氧和过氧化氢，因而具有防御氧毒性，增强机体抗辐射损伤能力，还可预防衰老，在一些疾病如肿瘤、炎症及自身免疫疾病等的治疗中有良好的疗效，因此研究开发CUZNSOD倍受人们的重视。然而，目前CUZNSOD大多是从天然动植物中提取，来源受到很大的限制，基因克隆和表达方面的研究报道相对较少。干酪乳杆菌是公认为安全的食品级微生物，但由于不含SOD，导致其对氧的耐受性较差，在有氧条件下生长较厌氧及微氧条件差，从而限制了其在工业中的应用。若以干酪乳杆菌作为表达CUZNSOD基因的受体菌株，可以集乳酸菌的益生功能和CUZNSOD蛋白的生物学特性于一体，有望开发出新一代功能性食品及微生态制剂，干酪乳杆菌工程菌本身及其表达产物可直接应用于食品工业、医药工业和保健业等领域，有着巨大的应用前景和潜在的商业价值。本研究利用基因工程方法，构建大肠杆菌CUZNSOD目的基因的表达重组子，将其电转化至干酪乳杆菌，并对重组菌进行初步检测鉴定，为进一步研究CUZNSOD的表达对干酪乳杆菌生物学特性的影响、开发可直接食用型SOD产品或微生态制剂奠定基础。研究内容主要分为两个部分①ECOLICUZNSOD基因的克隆根据GENBANK中发表的SODC基因序列，利用PRIMERPRIMER50软件设计并合成了一对引物P15GTGGAGCTCACGGAGGTCCTATGAAACG3、P25CAGGGTACCTACAGCGGATTTTGGGGACA3；通过优化的PCR反应条件，从ECOLIMGL655的基因组DNA中扩增出长685BP的SODC基因片段；通过T4DNA连接酶将其连接到克隆载体PMD18T中，构建重组质粒PTSODC，再将其转化至大肠杆菌DH5A中；然后提取质粒并进行酶切、PCR鉴定和序列测定。结果表明成功地克隆了ECOLICUZNSOD基因片段。②ECOLICUZNSOD基因重组干酪乳杆菌的构建利用软件设计并合成了一对引物PF5CTGTCTAGAATGAAACGTITFAGTCTGGC3、PR5CGCAAGCTTCTTATTACACCACAGGCA3；以PTSODC为模板进行PCR扩增，扩增产物克隆至PMDL8T中，构建重组质粒PMD18TSODC；双酶切后将SODC基因的全编码序列克隆至PMG36E的XBAI和HINDⅢ之间的多克隆位点上，构建表达重组子PMG36ESODC；然后通过优化的电转化条件电压25KV，电阻100Ω，电容25UF，将PMG36ESODC转化至干酪乳杆菌LBCASEI，并对重组菌株进行质粒抽提、PCR鉴定、酶切鉴定。结果表明成功地构建了重组干酪乳杆菌。这一技术平台为功能基因通过PMG36E载体在干酪乳杆菌中表达而更好的发挥转基因工程乳酸菌的双重功能开创了一条崭新的道路。
